要测定蛋白质的二硫键位置，需用什么方法？
2019-12-12
对角线电泳是一种经典的二硫键定位分析方法.这种技术包括：（1）胃蛋白酶酶切未经还原的蛋白质；（2）在酸性pH＝6．5的条件下进行第一向电泳,酶解产物肽段将按其大小及电荷的不同而分离；
（3）将滤纸暴露在过甲酸（CHOOOH）蒸气中,使二硫键氧化断裂,并进一步氧 化成磺酸基,被氧化的半胱氨酸称为磺基 丙氨酸；
（4）将滤纸旋转90.角,在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳.无二硫键的肽不受酸的作用而在两向电泳中迁移率相等,将位于一条对角线上.那些含二硫键的肽由于第二向电泳时被酸氧化,肽段大小和负电荷发生变化而使迁移率不同,将偏离对角线.肽斑可通过茚三酮显色来确定.将含磺基丙氨酸的肽段分别取下,进行氨基酸序列分析,推断二硫键的位置.如果蛋白质中存在其他未成二硫键的半胱氨酸,要先用碘乙酰胺封闭其一SH后再酶解.此外甲硫氨酸和色氨酸也能被氧化,这样可能会增加分析的复杂性.
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