甘油冷冻保藏法

本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。

（1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。

（2）平皿倒置于30℃或37℃恒温培养箱，培养24-48小时，至单菌落的大小为3mm左右。

（3）挑取一个单菌落，接种于一个装50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振荡培养10-15小时，至菌密度OD600为1.0-1.5。

（4）用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，及是否有杂菌。

（5）按30%甘油：种子液为1：1（V/V）的量加入无菌甘油， 混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（1-2mL/管），-70℃或液氮保存。

甘油冷冻保藏管制法简单，但是在制作过程中，应注意使用纯菌悬液不是含有培养基的增菌液，避免在冷冻保藏中保藏管中营养物质，干扰菌种的保藏。

菌悬液应有一定的浓度，防止在菌种的长时间保藏过程中，由于细菌细胞的自然死亡引起的细菌数量的急剧下降。这样有利于菌种的长时间保藏，并且不会由于上述方法制成的菌种的保藏时间较长，至少可保存两年；

甘油小管的体积小，不占位置；但是甘油冷冻管不能直接用于生产，必须经过转接于其他适宜的培养基上并经培养后才能用于生产。

不是每一类菌种都可用甘油冷冻管保藏法保藏，需氧细菌和酵母菌可用此法保藏，其他类细菌，如霉菌和厌氧菌则不适于用此法保藏。

经过解冻的菌种培养物不宜再用来保藏。