(1)脂肪酸的活化:脂肪酸的氧化首先须被活化，在ATP、CoA-SH、Mg2+存在下，脂肪酸由位于内质网及线粒体外膜的脂酰CoA合成酶催化生成脂酰CoA。

活化的脂肪酸不仅为一高能化合物，而且水溶性增强，因此提高了代谢活性。

(2)脂酰CoA的转移:脂肪酸活化是在胞液中进行的，而催化脂肪酸氧化的酶系又存在于线粒体基质内，故活化的脂酰CoA必须先进入线粒体才能氧化，但已知长链脂酰辅酶A是不能直接透过线粒体内膜的，因此活化的脂酰CoA要借助L-肉碱(L-carnitine)，即L-3-羟基-4-三甲基铵丁酸，而被转运入线粒体内，在线粒体内膜的外侧及内侧分别有肉碱脂酰转移酶I和酶Ⅱ，两者为同工酶。

位于内膜外侧的酶Ⅰ，促进脂酰CoA转化为脂酰肉碱，后者可借助线粒体内膜上的转位酶(或载体)，转运到内膜内侧，然后，在酶Ⅱ催化下脂酰肉碱释放肉碱，后又转变为脂酰CoA.这样原本位于胞液的脂酰CoA穿过线粒体内膜进入基质而被氧化分解。

一般10个碳原子以下的活化脂肪酸不需经此途径转运，而直接通过线粒体内膜进行氧化。

(3)脂酰CoA的β氧化:脂酰CoA进入线粒体基质后，在脂肪酸β氧化酶系催化下，进行脱氢、加水，再脱氢及硫解4步连续反应，最后使脂酰基断裂生成一分子乙酰CoA和一分子比原来少了两个碳原子的脂酰CoA.因反应均在脂酰CoA烃链的α，β碳原子间进行，最后β碳被氧化成酰基，故称为β氧化。